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NGS實(shí)驗(yàn)室建設(shè)詳解

2024-08-29

什么是NGS

NGS技術(shù)是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)非常關(guān)鍵的技術(shù)。精準(zhǔn)診斷離不開(kāi)分子診斷，而NGS技術(shù)是其中最難亦是應(yīng)用最廣的一項(xiàng)分子診斷技術(shù)。

由于NGS檢測(cè)具有很高的靈敏度，在NGS檢測(cè)過(guò)程中，樣本源性污染、Index源性污染、擴(kuò)增產(chǎn)物污染以及氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果。因此，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行合理有效的分區(qū)規(guī)劃是至關(guān)重要的。

NGS實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)要點(diǎn)

NGS實(shí)驗(yàn)室的面積

在建設(shè)NGS實(shí)驗(yàn)室時(shí)需注意總體面積不宜過(guò)大，以免能耗消耗非常大。此外，在實(shí)驗(yàn)室各區(qū)比例的設(shè)置上不要求平均比例，有的環(huán)節(jié)很小即可，有的環(huán)節(jié)可相對(duì)較大一些，即比例要合適。隨著醫(yī)院對(duì)NGS實(shí)驗(yàn)室的支持力度越大，要求也越為嚴(yán)格，應(yīng)設(shè)置適當(dāng)?shù)姆块g數(shù)。

2.NGS實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)向

其一，NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用全新風(fēng)系統(tǒng)，而不能使用普通家用空調(diào)。新風(fēng)系統(tǒng)可排出污染，而這是防污染最基礎(chǔ)的設(shè)置。

其二，需注意整個(gè)房間的氣流方向應(yīng)形成對(duì)流才有效。

其三，目前出現(xiàn)問(wèn)題較大的是生物安全柜、通風(fēng)柜和超凈工作臺(tái)這三種設(shè)備的合理配置使用。

NGS實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則

各區(qū)獨(dú)立
實(shí)驗(yàn)室各個(gè)區(qū)域無(wú)論是在物理空間上還是實(shí)際使用過(guò)程中，都應(yīng)當(dāng)處于完全分隔狀態(tài)，并且各區(qū)域之間不能有空氣的直接流通。
單一流向
NGS檢測(cè)通常涉及PCR擴(kuò)增及核酸純化富集等過(guò)程，任何樣本源性污染、分析標(biāo)簽源性污染、擴(kuò)增產(chǎn)物污染或氣溶膠污染均可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，因此各實(shí)驗(yàn)區(qū)域與緩沖間應(yīng)有一定的通風(fēng)壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染。
因地制宜
新建實(shí)驗(yàn)室除合理規(guī)范外，也要易于管理;若原有實(shí)驗(yàn)室通過(guò)合理的規(guī)劃改造也能滿足質(zhì)量管理要求，亦可不必特地新建實(shí)驗(yàn)室。
便于工作
實(shí)驗(yàn)室區(qū)域選擇及空間設(shè)計(jì)還應(yīng)最大限度考慮是否方便日常監(jiān)測(cè)工作，包括方便人員流動(dòng)效率、大型儀器設(shè)備進(jìn)出落地等。

NGS實(shí)驗(yàn)室布局說(shuō)明

試劑準(zhǔn)備區(qū)
本區(qū)應(yīng)為潔凈區(qū)域，用于配制試劑、儲(chǔ)存試劑及消耗品。若其他區(qū)污染通過(guò)空氣流入該區(qū)域內(nèi)，將影響后續(xù)操作流程和最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以需獨(dú)立成區(qū)。此外，該區(qū)還需設(shè)置正負(fù)壓緩沖間，避免實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外空氣流通。后續(xù)各區(qū)域的緩沖間設(shè)置原則同該區(qū)一樣。
標(biāo)本制備區(qū)
本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA提取及其定量和濃度檢測(cè)。起始DNA模板的質(zhì)量和測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性緊密相關(guān)，需嚴(yán)格遵循防污染要求，避免下游擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)其污染。

若樣本為福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，還需設(shè)置標(biāo)本制備前區(qū)，用于標(biāo)本切片和HE染色。

3.打斷區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于樣本DNA片段化。人類基因組DNA長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，而NGS檢測(cè)的DNA片段范圍在200~300bp左右，所以在文庫(kù)制備前需要進(jìn)行片段化處理，常用的有超聲打斷的物理方法。

若空間有限，可在標(biāo)本制備區(qū)專門劃分打斷區(qū)域，但需注意打斷后的樣本不在該區(qū)域開(kāi)蓋轉(zhuǎn)管，以免污染其他DNA模板，同時(shí)做到定期清潔打斷區(qū)。

耗消耗非常大。此外，在實(shí)驗(yàn)室各區(qū)比例的設(shè)置上不要求平均比例，有的環(huán)節(jié)很小即可，有的環(huán)節(jié)可相對(duì)較大一些，即比例要合適。隨著醫(yī)院對(duì)NGS實(shí)驗(yàn)室的支持力度越大，要求也越為嚴(yán)格，應(yīng)設(shè)置適當(dāng)?shù)姆块g數(shù)。

4.文庫(kù)制備區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于構(gòu)建文庫(kù)。DNA經(jīng)片段化處理后產(chǎn)生粘性末端，需先修復(fù)補(bǔ)平為平末端，并在3'端加上“A”尾。之后，再在片段兩端加上接頭和標(biāo)簽。若接頭或標(biāo)簽出現(xiàn)污染，導(dǎo)致樣本間數(shù)據(jù)錯(cuò)分，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性也無(wú)法保證。

當(dāng)標(biāo)本量較少，且標(biāo)簽是通過(guò)DNA連接酶的非PCR反應(yīng)加上的，則標(biāo)本制備區(qū)和文庫(kù)制備區(qū)可合并。

5.擴(kuò)增一區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫(kù)的預(yù)擴(kuò)增和純化。文庫(kù)擴(kuò)增涉及PCR過(guò)程，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠，需獨(dú)立成區(qū)。

6.雜交捕獲區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于捕獲目的序列。

7.擴(kuò)增二區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于對(duì)捕獲后的文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)終文庫(kù)的濃度和片段大小進(jìn)行檢測(cè)以及測(cè)序文庫(kù)的pooling工作。

8.測(cè)序區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。房間溫度控制在18~22℃，2小時(shí)溫度波動(dòng)應(yīng)小于2℃；濕度保持在20%~60%；避免人為引起的震動(dòng)。

9.電泳區(qū)

本區(qū)為半污染區(qū)，用于檢測(cè)提取后的DNA和超聲打斷后的DNA片段分析。

規(guī)劃好各功能區(qū)后，還需配備相應(yīng)的儀器設(shè)備，同時(shí)做上明確標(biāo)記，避免不同區(qū)域間的設(shè)備發(fā)生混淆，造成交叉污染。